Cher Microbe

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Depuis Pasteur, on sait que le tractus gastro-intestinal humain est essentiellement un bioréacteur de type à flux, dans lequel vivent de nombreux microorganismes. L'attitude des scientifiques à l'égard de la microflore intestinale a radicalement changé au cours de cette période. Il y a cent ans, le grand Ilya Mechnikov, fondateur de la théorie moderne de l'immunité, pour la création de laquelle il a reçu le prix Nobel (pour deux avec son adversaire implacable, le non moins grand Paul Ehrlich), a même proposé de supprimer le gros intestin comme moyen de prolonger la vie. Et à ceux pour qui cette mesure semblait trop radicale, j'ai recommandé de boire le plus de kéfir possible afin de supprimer les microbes nocifs, à son avis, avec des bactéries lactiques bénéfiques. Après un demi-siècle, le parcours a changé de 180 degrés. Il s'est avéré que la microflore intestinale normale, ainsi que la peau et les muqueuses, remplit de nombreuses fonctions utiles - par exemple, elle supprime l'activité vitale des micro-organismes pathogènes qui attaquent constamment le corps. Et au cours des dernières années, les microbiologistes les plus courageux sont allés encore plus loin, déclarant l'homme et ses microbes comme un simple superorganisme symbiotique.

Le développement des méthodes de biologie moléculaire a amené les scientifiques à un nouveau niveau de compréhension des processus de symbiose de l'homme et de sa microflore, qui semblaient avoir été bien étudiés et dont l'étude ne devrait pas attendre de surprises spéciales. L’augmentation rapide de la vitesse et la baisse du coût des méthodes de séquençage de l’ADN (détermination de sa séquence nucléotidique) ainsi que l’augmentation parallèle de la puissance des ordinateurs personnels et du développement d’Internet ont permis d’analyser des informations sur de grandes régions du génome. Une fois que les chromosomes de centaines d’espèces bactériennes ont été déchiffrés, une nouvelle approche est apparue dans la génétique des micro-organismes: l’approche en population: l’analyse des gènes de toutes les bactéries qui habitent une zone donnée à la fois. Bien entendu, la population du «bioréacteur humain» s’est avérée être l’une des plus importantes pour l’étude des populations microbiennes.

Le premier travail, qui a conduit à un nouveau regard sur le microbiote intestinal, a été publié en 1999 par un groupe de scientifiques de l'Institut national de recherche agronomique (France) et de l'Université de Reading (Royaume-Uni). Les auteurs ont décidé d'appliquer la méthode de séquençage des gènes de l'ARN 16S à l'étude de la population microbienne de l'intestin.

ARN 16S - ID de bactérie

Depuis Pasteur, la première étape nécessaire à la détermination des microorganismes a été leur culture sur des milieux nutritifs. Mais de nombreux microbes importants (et bénéfiques, et pathogènes) ne veulent pas se développer dans aucun milieu. Il était possible d'étudier des bactéries non cultivées jusque-là inaccessibles et de commencer à rétablir l'ordre dans la systématique extrêmement enchevêtrée de procaryotes déjà connus avec le développement de la bioinformatique et l'émergence de méthodes modernes de biologie moléculaire - la réaction en chaîne de la polymérase (PCR), qui permet d'obtenir des millions et des milliards de copies exactes à partir d'un seul segment d'ADN, clonage sélectionné utilisant des gènes de PCR dans des plasmides bactériens et des techniques de séquençage de séquences nucléotidiques obtenues à la suite de tout montant Iza.

Le gène codant pour l'ARN ribosomal 16S (chacune des deux sous-unités du ribosome - ateliers de synthèse de protéines - est constitué de molécules de protéines entrelacées et de chaînes d'acides ribonucléiques) constitue un marqueur idéal pour l'identification de micro-organismes.

Ce gène est dans le génome de toutes les bactéries et archées connues, mais il est absent chez les eucaryotes et les virus, et si vous avez trouvé sa séquence nucléotidique caractéristique, vous avez certainement affaire aux gènes des procaryotes. (Pour être très précis, le gène de l'ARN 16S existe également chez les eucaryotes, mais pas dans les chromosomes nucléaires, mais dans les chromosomes mitochondriaux. Ceci confirme une fois de plus que les mitochondries sont des descendants lointains des bactéries symbiotes des premiers organismes eucaryotes.)

Ce gène a à la fois des régions conservatrices, les mêmes pour tous les procaryotes et des espèces spécifiques. Les sites conservateurs servent pour la première étape de la réaction en chaîne de la polymérase - attacher l’ADN à tester aux amorces (sites de germination de l’ADN auxquels la chaîne de nucléotides étudiée doit se joindre pour commencer à analyser le reste de la séquence), et spécifiques à une espèce - pour déterminer l’espèce. De plus, le degré de similarité des parcelles spécifiques à une espèce reflète très bien la parenté évolutive de différentes espèces.

Un avantage supplémentaire est que, pour le clonage et l'analyse ultérieure, vous pouvez utiliser l'ARN ribosomal lui-même, qui est présent dans n'importe quelle cellule en quantité beaucoup plus grande que son gène correspondant. Seulement vous devez d’abord le "réécrire" dans l’ADN en utilisant une enzyme spéciale - la transcriptase inverse.

Les séquences nucléotidiques de l'ARN 16S de toutes les bactéries et archées connues (environ 10 000 espèces) sont largement disponibles. Les séquences identifiées sont comparées à celles des bases de données et identifient avec précision le type de bactérie ou le déclarent comme appartenant à la prochaine espèce non cultivée.

Récemment, il y a eu une révision intensive de l'ancienne classification phénotypique des bactéries, basée sur des critères peu formalisés - de l'apparition des colonies aux préférences alimentaires et à la possibilité d'être colorée avec divers colorants. La nouvelle systématique est basée sur des critères moléculaires (ARN 16S) et ne répète que partiellement le phénotypique.

Les séquences codantes de l'ARN 16S à l'aide de la PCR ont été extraites directement de «l'environnement» - 125 milligrammes d'humain, excusez-moi, ont été insérés dans les plasmides d'Escherichia coli (non parce qu'il est intestinal, mais parce qu'Escherichia coli est l'un des chevaux de bataille préférés des biologistes moléculaires ) et à nouveau isolé de la culture de bactéries propagées. Ainsi, la banque de gènes d'ARN 16S de tous les microorganismes de l'échantillon a été créée. Après cela, 284 clones ont été sélectionnés au hasard et séquencés. Il s'est avéré que seulement 24% des séquences d'ARN 16S obtenues appartenaient à des microorganismes connus antérieurement. Depuis plus de cent ans, les trois quarts de la microflore présente dans l'intestin de chaque personne ont échappé à l'attention de chercheurs armés des méthodes de la microbiologie classique! Les scientifiques n'ont tout simplement pas pu trouver les conditions pour la culture de ces bactéries, car les habitants les plus capricieux de l'intestin ont refusé de se développer sur des supports microbiologiques traditionnels.

Aujourd'hui, en utilisant des méthodes moléculaires, il a été établi que 10 des 70 grands taxons bactériens sont représentés dans le microbiote d'un adulte. Environ 90% de nos microbes appartiennent aux types Firmicutes (par exemple, les lactobactéries bien connues sont les principaux «coupables» du lait acidifiant) et les bactéroïdes sont des anaérobies obligatoires (organismes ne pouvant vivre que sans oxygène), qui sont souvent utilisés comme indicateurs de pollution eaux naturelles eaux usées. Les 10% restants de la population sont répartis entre les taxons de Protéobactéries (notamment E. coli), les Actinobactéries (l’un des types d’actinomycètes étant un antibiotique isolé streptomycine), les Fusobactéries (habitants ordinaires de la cavité buccale et cause commune de la maladie parodontale), Verrucomicrobia (récemment). une source géothermique est une espèce de ces microbes qui se nourrissent de méthane, qui est abondant dans l'intestin en raison de l'activité vitale d'autres micro-organismes), les cyanobactéries (on les appelle encore souvent l'ancien nom «algues bleu-vert»), les spirochées ( tew, not pale), Synergistes et VadinBE97 (quel genre d’animaux sont-ils, demandez aux créateurs de la nouvelle systématique procaryote).

Bien que la composition en espèces des microorganismes intestinaux soit plutôt monotone, le rapport quantitatif des représentants de certains groupes systématiques dans le microbiote de différentes personnes peut varier considérablement. Mais quelle est la microflore intestinale normale et quels sont les moyens de sa formation?

Un groupe de biologistes américains dirigé par Patrick Brown de l’Université de Stanford a répondu à cette question en 2007. Ils ont retracé la formation de microbiote chez 14 nouveau-nés au cours de la première année de vie. Les auteurs ont pu établir plusieurs sources de colonisation du tractus gastro-intestinal. Le microbiote des bébés présentait des similitudes avec la microflore de la mère: vaginale, fécale ou microflore d'échantillons de lait maternel. En fonction des sources de colonisation, différentes espèces prévalaient dans la microflore intestinale des nourrissons au cours de la première année de vie. Ces différences sont restées significatives pendant toute la durée de l'étude, mais à l'âge d'un an, la formation du microbiote chez l'adulte est devenue perceptible. Des données intéressantes ont été obtenues sur l'exemple d'une paire de jumeaux. La microflore en eux était presque identique dans la composition et a changé de la même manière aussi. Cette découverte a révélé le rôle énorme de la composante humaine du couple microbiote-hôte dans la formation de la population de microflore intestinale. Pour la pureté de l'expérience, bien sûr, il serait nécessaire de séparer les bébés tout en restant à l'hôpital - une belle histoire pour un film indien! Au fil des ans, ils ont appris à se connaître par analyse... Mais les données d’autres travaux ont confirmé l’hypothèse voulant que l’individu, y compris les caractéristiques héréditaires de la biochimie humaine, aient une grande influence sur la composition de son microbiote.

Microbien en nous plus qu'humain

En plus d'étudier certains types de microflore intestinale, de nombreux chercheurs ont étudié le métagène bactérien au cours des dernières années, soit un ensemble de gènes de tous les microorganismes présents dans un échantillon du contenu de l'intestin humain (éliminé par lavage de la peau ou dans un échantillon de limon provenant des fonds marins). Pour ce faire, ils utilisent les technologies de séquençage d’ADN les plus automatisées, les plus informatisées et les plus performantes, qui permettent d’analyser de courtes séquences de nucléotides, d’assembler un puzzle autour de plusieurs lettres correspondantes aux extrémités de ces sections, de répéter cette procédure à plusieurs reprises pour chaque morceau du génome et d’obtenir rapidement le décodage de gènes et de chromosomes individuels. jusqu’à 14 millions de nucléotides par heure - des ordres de grandeur plus rapides que cela n’avait été fait il ya quelques années. Ainsi, il a été découvert que le microbiote de l'intestin humain contient environ 100 trillions de cellules bactériennes - environ 10 fois plus que le nombre total de cellules dans l'organisme hôte. L'ensemble des gènes qui composent le métagénome bactérien est environ 100 fois plus grand que l'ensemble des gènes du corps humain. Si nous parlons du volume de réactions biochimiques qui se produisent dans la population microbienne, il est encore beaucoup plus élevé que celui du corps humain. Le «réacteur» bactérien met en œuvre dans l’organisme hôte des chaînes métaboliques qu’il ne peut pas supporter - par exemple, la synthèse de vitamines et de leurs précurseurs, la décomposition de certaines toxines, la décomposition de la cellulose en polysaccharides digestibles (chez les ruminants), etc.

Des études menées dans le laboratoire de Jeffrey Gordon (école de médecine de l’Université de Washington, St. Louis, Missouri) ont permis d’associer la diversité des espèces de bactéries du tractus gastro-intestinal au régime alimentaire et aux caractéristiques métaboliques de l’individu. Les résultats de l'expérience ont été publiés dans le numéro de décembre 2006 de Nature. L'expérience d'un an a suggéré d'établir une corrélation entre l'excès de poids chez l'homme et la composition de la population microbienne de ses intestins. Une douzaine de personnes grasses qui ont accepté de mettre leur ventre sur l'autel de la science ont été divisées en deux groupes. L'un a suivi un régime faible en gras, l'autre un régime faible en glucides. Tous les volontaires ont perdu du poids tout en modifiant le rapport entre les deux principaux groupes de micro-organismes intestinaux: le nombre de cellules Firmicutes a diminué et le nombre de Bacteroidetes, au contraire, a augmenté. Une telle modification est devenue perceptible plus tard avec un régime pauvre en graisses (après que les patients ont perdu 6% de leur poids et avec un régime faible en glucides) après avoir perdu les premiers kilogrammes (2% de leur poids corporel initial). Dans ce cas, l’évolution de la composition de la microflore était d’autant plus prononcée que le poids des participants à l’expérience diminuait.

Parallèlement, dans le même laboratoire, des expériences ont été menées sur des souris de laboratoire portant une mutation du gène de la leptine, «l'hormone de satiété», une protéine synthétisée dans les cellules du tissu adipeux et contribuant à la formation d'une sensation de satiété. Les souris qui ont endommagé les deux copies de ce gène (cette mutation est indiquée par l'indice de Lep ob) mangent 70% de plus que le type sauvage, avec toutes les conséquences qui en découlent. Et le contenu des Firmicutes dans leurs intestins est une fois et demie supérieur à celui des lignées hétérozygotes, avec un seul allèle défectueux (ob / +), et homozygote pour le gène normal des lignées de type sauvage (+ / +).

L'influence de la microflore sur le métabolisme de son "propriétaire", les chercheurs ont vérifié sur un autre modèle - souris gnotobioticheskimi.

Ces animaux, qui vivent dans des chambres stériles depuis leur naissance et qui n'ont jamais rencontré un seul microbe, ne sont pas souvent utilisés dans la recherche biomédicale. La stérilité absolue de la musculature, des lapins et plus particulièrement des chèvres est coûteuse et gênante, et après avoir rencontré le premier microbe ou le premier virus, les pauvres créatures mourront ou ne seront plus utilisables. Ce qui se passe dans gnotobiotov avec le système immunitaire est une histoire distincte, et ils mangent pendant trois et en même temps - la peau et les os en raison de l'absence d'un composant microbien de la digestion.

Après la transplantation de microflore de donneurs obèses (ob / ob), la souris gnatobiot s'est épaissie de près d'une fois et demie (47%) en deux semaines. Ceux qui ont été ensemencés de microflore de donneurs de type sauvage (+ / +) de poids normal ne se sont rétablis que de 27%.

Les résultats d’une étude plus approfondie des modifications de l’organisme symbiotique souris-microbien ont permis de confirmer avec brio l’hypothèse selon laquelle le microbiote d’individus obèses contribue à un traitement plus en profondeur des aliments. La comparaison d'échantillons d'ADN de selles de souris obèses et normales a montré que les microbiomes d'obésité sont saturés de gènes d'enzymes qui permettent une dégradation plus efficace des polysaccharides. Les intestins de souris grasses contenaient de grandes quantités de produits finis de la fermentation - composés d'acides acétique et butyrique -, ce qui indique un traitement plus en profondeur des composants alimentaires. Analyse calorimétrique (du mot «calories»!) L'analyse d'échantillons de selles l'a confirmé: les selles des souris ob / ob contenaient moins de calories que les souris de type sauvage, qui n'absorbaient pas pleinement l'énergie des aliments.

Outre les informations importantes sur la composante «microbienne» de l'obésité, les auteurs ont pu montrer la similitude fondamentale de la microflore chez les personnes obèses et les souris, ce qui ouvre de nouvelles perspectives pour l'étude du problème du surpoids, voire de la «transplantation» d'une microflore saine ou de sa formation chez des patients obèse.

Le fait que le microbiote puisse contrôler le métabolisme de l'hôte ne fait plus de doute. Les recherches de Gordon sur l'excès de poids ont permis de jeter des passerelles vers le traitement de maladies métaboliques, telles que l'épuisement général des enfants âgés de un à quatre ans dans les pays pauvres au climat tropical - marasme (ce mot n'a qu'un rapport linguistique avec le marasme: marasmos grecs signifie littéralement épuisement, extinction) et kwashiorkor (dans le langage de l'une des tribus du Ghana, kwashiorkor - «garçon rouge»). L’émergence de maladies est associée à un manque de protéines et de vitamines pendant la transition de l’allaitement à la nourriture pour adultes. Mais la maladie affecte de manière sélective les enfants dont les frères et sœurs n’ont rencontré aucun problème lors du passage au régime traditionnel de la région. Des études ont montré que la microflore intestinale des enfants malades est très différente de la microflore de leurs parents et de celle des frères et sœurs en bonne santé. Tout d'abord, il a été noté l'absence presque complète de bactéroïdes dans la population intestinale et la prédominance d'espèces rares appartenant aux types de protéobactéries et de fusobactéries. Après que des enfants malades (avec précaution, afin de ne pas faire une overdose!) Aient été nourris avec des aliments riches en protéines, leur microbiote est devenu similaire à la normale, comme chez les proches, avec une prédominance de Bacteroidetes et de Firmicutes.

Des études récentes ont non seulement fondamentalement changé la compréhension actuelle de la microflore intestinale humaine, mais ont également contribué à l'émergence d'un concept qui considère le microbiote intestinal comme un "organe" multicellulaire supplémentaire du corps humain. Organe composé de différentes lignées cellulaires capables de communiquer entre eux et avec l'organisme hôte. Le corps qui redistribue les flux d'énergie, effectue des réactions physiologiques importantes, change sous l'influence de l'environnement et s'auto-régénère lorsque des changements sont causés par des conditions extérieures.

Poursuivre l’étude de «l’organe bactérien» peut et devrait permettre de mieux comprendre les lois régissant son fonctionnement, de révéler ses liens subtils avec l’organisme hôte et, partant, d’apparaître de nouvelles méthodes de lutte contre les maladies humaines par le traitement ciblé des dysfonctionnements des deux composants du métaorganisme.

Valery Poroiko, Ph.D.
Université de Chicago, Département de chirurgie générale
Portail "Jeunesse éternelle" www.vechnayamolodost.ru

Version de journal de l'article publié dans Popular Mechanics No. 4-2008

Identification d'espèces de bactéries par séquençage du gène 16S de l'ARN ribosomal, rôle et place de la méthode dans le diagnostic des infections bactériennes Complété: Saveliev. - présentation

La présentation a été publiée il y a 4 ans par Ludmila Shumikhina

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1 Identification des espèces de bactéries par séquençage du gène 16S de l'ARN ribosomal, rôle et place de la méthode dans le diagnostic des infections bactériennes : Cand. biol. Afonyushkin Vasily Nikolaevich PhD biol. Afonyushkin Vasiliy Nikolaevich

2 tâches: 1. Maîtriser la méthode d'électrophorèse de l'ADN en gel d'agarose 2. Maîtriser la méthode d'analyse des résultats de séquençage et construire les séquences nucléotidiques de fragments du gène 16 S de l'ARN ribosomal d'isolats du genre Bacillus isolés 1. Maîtriser la méthode d'électrophorèse d'ADN dans le gel d'agarose 2. Maîtriser la méthode d'analyse des résultats de séquençage et procéder à la construction de séquences nucléotidiques de fragments du gène 16 S de l'ARN ribosomal des isolats obtenus du genre Bacillus 3. Examiner les perspectives d'utilisation conjointe des méthodes de séquençage et de la biochimie identification des bactéries 3. Etudier les possibilités de partage des méthodes de séquençage et d'identification biochimique des bactéries Objectif: Etudier les possibilités de la méthode d'identification spécifique des bactéries en utilisant la méthode de séquençage du gène 16S de l'ARN ribosomal en combinaison avec les méthodes d'identification traditionnelles.

3 matériels et méthodes Des cultures pures d'isolats ont été semées sur du MPA et, après des heures d'incubation, une suspension bactérienne a été préparée sur un tampon phosphate-sérum physiologique. Les cultures ont été colorées par Gram et au microscope. Evalué propriétés biochimiques suivantes: citrate d'épuration, le malonate, le glucose, le lactose, le mannitol, le saccharose, l'inositol, le sorbitol, l'arabinose, le maltose, la phénylalanine, la formation d'indole, le sulfure d'hydrogène, atsetilmetilkarabinola (Réaction Foges- Proskauer), la présence de bêta-galactosidase, l'uréase, la décarboxylase de l'arginine et la lysine, l'arginine hydrolase. Les cultures ont été testées pour la catalase, les activités de cytochrome oxydase, la formation de nitrites, la synthèse de pigments, la résistance aux antibiotiques, et ont étudié les propriétés culturelles et morphologiques. La bêta-galactosidase, et l'activité tritofandezaminaznuyu glyukoronidaznuyu a été testé sur un milieu Uriselekt 4 (BioRad) L'ADN a été isolé par vue fenolhloroformennym déterminé sur la base du séquençage de 16S du gène ribosomal de fragment d'ARNi de l'élément d'espacement intergénique de l'ARN ribosomal et 16-23S pluralité de caractéristiques biochimiques, culturelles et morphologiques.

4 Biens culturels: les cultures cultivées n’ont pas poussé sur le support Endo, c.-à-d. n'appartient pas aux entérobactéries, a grandi sur gélose à la viande de peptone et dans des conditions aérobies à 37 ° C. Propriétés tactorielles: les cultures cultivées ont été examinées au microscope et marquées au Gram, ce qui a permis d'établir que les cultures obtenues appartenaient à des tiges Gr + formant des spores Caractéristiques des cultures

5 Plan de l'étude: l'ADN a été isolé à partir de cultures et la PCR a été mise en place avec des amorces universelles; nous avons ainsi amplifié un fragment du gène 16S de l'ARN ribosomal.

6 Une solution avec une amorce est répartie dans 4 éprouvettes contenant chacune 4 désoxynucléotides dATP, dTid, dTPP (l’un d’eux est marqué d’un isotope radioactif) et l’un des quatre 2; il est activé dans toutes les positions du mélange en croissance et, après sa fixation, la croissance de la chaîne s'arrête immédiatement. En conséquence, dans chacun des quatre tubes, avec la participation de l'ADN polymérase, un ensemble unique d'oligonucléotides de différentes longueurs est formé, y compris la séquence d'amorce. Ensuite, on ajoute du formaldéhyde aux tubes pour séparer les chaînes et on effectue une électrophorèse sur gel de polyacrylate sur quatre voies. La radioautographie est effectuée, ce qui vous permet de "lire" la séquence nucléique du segment d'ADN à séquencer. En biochimie et en biologie moléculaire, l'électrophorèse est utilisée pour séparer les macromolécules de protéines et les acides nucléiques (ainsi que leurs fragments). Il existe de nombreuses variétés de cette méthode. Cette méthode trouve la plus large application pour la séparation de mélanges de biomolécules en fractions ou en substances individuelles et est utilisée dans les domaines de la biochimie, de la biologie moléculaire, du diagnostic clinique, de la biologie des populations (pour étudier la variabilité génétique) et d’autres acides nucléiques-protéines. solutions) en milieu liquide ou gazeux sous l'action d'un champ électrique externe. Phénomène électrocinétique du champ électrique Electrophorèse Conception de l'étude: Les produits de PCR ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose. Méthode Sanger

7 Résultats de nos propres recherches Fig.1 Résultats de l'électrophorèse capillaire d'un fragment du gène 16 S de l'ARN ribosomal

8 Figure 2 arbre phylogénétique construit sur la base des résultats de l’alignement d’un fragment du gène 16S de l’ARN ribosomal

9 Résultats de recherches propres Pic. 3 Résultats de la comparaison des séquences de nucléotides

10 Résultats des études biochimiques de cultures utilisant des PBDE Propriétés biochimiques de la souche de B.licheniformis: utilisation du citrate négative, malonate négative, citrate de sodium + glucose négative, lysine négative, arginine négative, ornithine négative, phénylalanine négative, indole négative, acétylméthylsilababène positive négatif, positif pour le glucose, positif pour la b-galactosidase, négatif pour le lactose, positif pour le saccharose, positif pour le saccharose, positif pour l'inositol oh, le sorbitol est positif, le maltose est positif

11 Conclusion L’identification spécifique des micro-organismes sur la base du séquençage peut constituer le «gold standard» des diagnostics de laboratoire. Cependant, l’exactitude de la méthode est limitée par l’exactitude et l’exhaustivité des bases de données GenBank et nécessite donc l’utilisation supplémentaire de tests de confirmation.

Analyse 16s ARN

Biotechnologie, 2005, №6, p 3-11

Une méthode d'identification de microorganismes basée sur l'analyse du polymorphisme de longueur de fragments de restriction (PDFR) d'un produit de PCR du gène de l'ARN 16S d'une longueur de 1500 nucléotides est proposée. Un ensemble de 6 endonucléases de restriction (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI et RsaI) a été sélectionné, ce qui permet l'identification d'un large éventail de micro-organismes à l'aide de PCGF.
Quatre isolats de phosphatase alcaline thermolabile ont été isolés à partir d’isolats naturels d’eau de mer. L'analyse du PDFR de ces souches par rapport aux résultats calculés obtenus pour les gènes d'ARN 16S de divers microorganismes a permis d'établir que les producteurs identifiés appartenaient au genre Alteromonas.

Outre les méthodes traditionnelles d’identification de microorganismes utilisant des caractéristiques culturelles et morphologiques, ainsi que des réactions chimiques et biochimiques [1], des méthodes de détermination de microorganismes basées sur la comparaison de séquences de nucléotides de divers gènes de microorganismes [2-4] et analyse du polymorphisme des longueurs de fragments de restriction d'ADN obtenues à la suite de l'amplification de gènes bactériens individuels [5, 6]. Les gènes codant pour l'ARN ribosomal 16S et 23S sont les plus appropriés pour l'identification car ils sont présents dans toutes les cellules bactériennes et sont spécifiques au genre de la plupart des microorganismes [7–9]. L'utilisation d'un fragment d'ADN contenant à la fois les gènes d'ARN 16S et 23S et l'espaceur qui les sépare, ce qui est plus variable, peut être utilisée pour identifier des espèces et des sous-espèces de microorganismes étroitement apparentées [10].

Cet article présente les résultats de l'analyse FDPR d'un produit de PCR d'une longueur de 1500 nucléotides pour différents microorganismes et il a été montré que l'utilisation de 6 endonucléases de restriction Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI et RsaI permet d'identifier de manière fiable la majorité des microorganismes. Dans ce travail, 4 nouveaux producteurs de phosphatase alcaline thermolabile ont été identifiés et en utilisant la méthode proposée, une analyse comparative de PDPR a été réalisée pour identifier ces microorganismes. Sur la base de la comparaison, il a été conclu que les producteurs trouvés appartenaient au genre Alteromonas.

CONDITIONS D'EXPERIENCE

Pour identifier les producteurs de phosphatase alcaline thermolabile, 50 µl d'eau de mer ont été broyés à la surface de la gélose nutritive et analysés comme décrit dans [11]. La production de biomasse de microorganismes a été réalisée en cultivant les producteurs à 20 ° C dans un bouillon contenant 1% de tryptone (AGS GmbH, Allemagne), 0,5% d’extrait de levure (même entreprise) et d’eau salée (NaCl - 27,5, MgCl2 - 5, MgSO4 - 2, CaCl2 - 0,5, KCl - 1, FeSO4 - 0,001 g / l [12]), pH 7,2 - 7,7. Le bouillon ensemencé a été distribué dans 200 ml de ballons à bascule de 700 ml et agité à 150 tr / min pendant 16 h.

L'isolement de l'ADN chromosomique a été réalisé selon la méthode de [13].

L'amplification du gène 16S de l'ARN ribosomal a été réalisée en utilisant une réaction en chaîne de la polymérase telle que décrite dans [14].

La réaction de restriction de l'ADN amplifié a été réalisée pendant 4 heures à 37 ° C dans 20 pi du mélange réactionnel contenant 2 unités. agir la restriction Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI ou RsaI produite par NPO SibEnzyme, dans le tampon correspondant. La réaction a été arrêtée par addition de 5 ul d'une solution d'arrêt contenant 0,1 M d'EDTA, 0,05% de bleu de bromophénol et 40% de saccharose.

La séparation électrophorétique des produits de l'ADN amplifié par restriction a été réalisée dans de l'agarose à 2% (Sigma) dans un tampon tris-acétate avec du bromure d'éthidium (0,5 mg / l) à 120 V pendant 4 h.

Pour déterminer la longueur des fragments d'ADN, des marqueurs de poids moléculaire d'ADN ont été utilisés (marqueurs d'ADN de 100 pb + 1,5 Kb, NPO SibEnzyme). La détermination des longueurs des restrictions obtenues a été effectuée à l'aide du programme informatique Gel Pro Analyzer, version 4.0.00.001. Le pourcentage d'identité des longueurs de fragments a été calculé pour chaque paire de microorganismes, en comparant les profils de restriction séparément pour chaque enzyme de restriction. Lors de la comparaison des longueurs de restriction, les fragments d'ADN ont été considérés comme identiques, leur longueur ne différant pas de plus de 5%.

Pour comparer les données expérimentales avec les séquences de gènes d'ARN 16S publiées, une banque de données génétiques des séquences séquencées a été utilisée.

RÉSULTATS ET DISCUSSION

À partir d'isolats naturels d'eau de mer, nous avons isolé quatre souches productrices de phosphatase thermolabile, désignées par 20, 27, 48 et la souche décrite précédemment [11] en utilisant des méthodes traditionnelles comme Alteromonas undina. Pour identifier les souches obtenues à partir de la biomasse de microorganismes cultivés dans un milieu nutritif liquide avec l'addition de sels marins, l'ADN chromosomique a été isolé.
Ensuite, l'ADN chromosomique a été utilisé dans la réaction en chaîne de la polymérase pour amplifier le gène 16S de l'ARN ribosomal. Le produit d'amplification a été traité indépendamment avec 6 endonucléases de restriction différentes. Toutes les restrictases que nous utilisons ont un site de reconnaissance des tétranucléotides, ce qui permet d’obtenir de 3 à 8 fragments d’ADN à la suite du clivage du produit d’amplification, qui a une longueur d’environ 1500 nucléotides. Les enzymes de restriction Sse9I et Tru9I utilisées possèdent respectivement les sites de reconnaissance AATT et TTAA, alors que les enzymes de restriction BsuRI et MspI traversent les sites GGCC et CCGG. Les sites de restriction BstMBI et RsaI, respectivement GATC et GTAC, contiennent les quatre nucléotides. À notre avis, une telle sélection d’endonucléases de restriction devrait conférer une universalité à l’identification des micro-organismes possédant des génomes à la fois riches en AT et en GC. En termes quantitatifs, nous considérons que l’utilisation précise de 6 enzymes de restriction différentes est optimale, car l’utilisation de 1 ou 3 restrictions, comme suggéré dans un certain nombre d’articles [10,15], peut ne pas révéler de polymorphisme lors de l’identification de microorganismes étroitement apparentés ou entraîner au contraire des différences trop importantes entre pour une ou plusieurs mutations aléatoires. Dans le même temps, l'utilisation de 10 endonucléases de restriction différentes ne conduit pas à une identification supplémentaire du polymorphisme de la longueur des fragments de restriction de l'ADN et est clairement excessive [9].
La figure 1 montre des modèles simulés par ordinateur de la restriction de gènes 16S pour l'ARN, un ensemble de six enzymes de restriction proposés par nous (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI et RsaI). Les gènes de l'ARN 16S proviennent de la banque génétique des séquences séquencées. Le choix des microorganismes était assez aléatoire. Toutes les bactéries appartiennent à des genres différents et représentent à la fois des microorganismes gram négatif et gram positif. On voit que, pour tous les micro-organismes, il existe un ensemble unique de restrictions. Le nombre de fragments d'ADN varie de 23 à 30 (les fragments de longueur inférieure à 100 paires de bases ne sont pas pris en compte). Les résultats du calcul du pourcentage d’identité des longueurs des fragments d’ADN (les restrictions considérées comme identiques ne diffèrent pas de plus de 5%) pour différentes paires de micro-organismes sont présentés dans le tableau 1. Ce tableau ne présente qu’une fraction des paires de micro-organismes possibles illustrées à la Fig. 1. Mais les résultats de comparaison présentés sont assez caractéristiques et permettent de constater que le pourcentage d'identité des longueurs de fragments d'ADN varie généralement entre 12 et 28% pour les représentants de différents genres de micro-organismes. Ainsi, les données présentées montrent que le schéma de restriction des gènes de l'ARN 16S avec l'ensemble des enzymes de restriction proposés par nous peut servir de base à l'identification du genre de cellules bactériennes.

Fig. 1. Schémas théoriquement calculés de la séparation électrophorétique des produits d'amplification des gènes de l'ARN 16S, après traitement avec la restrictase Sse9I (1), Tru9I (2), BsuRI (3), MspI (4), BstMBI (5) et RsaI (6). Tracks M - marqueur de poids moléculaire

La valeur de l'ARN 16S en systématique. Hybridation moléculaire de l'ARN 16S.

Hybridation moléculaire de l'ARNr 16S. Le ribosome procaryote est constitué de 3 sous-unités, grande (23S), (5S) et (16S). Gène 16S L'ARNr a les propriétés suivantes importantes dans la phylogénie:

1. Les ribosomes à ARN sont universels pour différentes espèces, comme les ribosomes eux-mêmes. 2. La molécule d'ARNr 16S est conservatrice et moins susceptible de changer au cours de l'évolution biologique. Le taux de changement du gène de l'ARNr 16S dans diverses bactéries symbiotiques était de 2 à 4% des substitutions de nucléotides sur 60 Myr.3. Le gène de l'ARNr 16S a des régions (domaines) ultraconservées et variables, ce qui permet d'évaluer les relations de parenté lointaines et étroites.4. En outre, il a été constaté que les cistrons d'ARNr ne sont pas impliqués dans les processus de transfert génétique interspécifiques.5. La taille du gène (chez les procaryotes, il a une longueur d'environ 1550-1640 pb) est optimale du point de vue de la réduction des erreurs statistiques. Une séquence complète peut être déterminée en une séquence en utilisant la méthode de Sanger Comparaison des répertoires de nucléotides. La méthode a été utilisée au début des années 80 et avait une grande importance historique dans la systématique des bactéries. Au même moment, la molécule d'ARN (ARNr 16S) a été traitée avec la ribonucléase T, qui clive la molécule en résidus de guanine. La taille des fragments obtenus ne dépasse pas 20 nucléotides. Les oligonucléotides résultants ont été séparés par électrophorèse en 2 dimensions, séquencés et compilés en un catalogue qui caractérise spécifiquement la molécule d'ARNr. Lors de la comparaison de catalogues, des fragments d’une longueur d’au moins 6 nucléotides ont été pris en compte. En appliquant les coefficients de similarité entre les catalogues, un arbre phylogénétique commun pour les procaryotes a été construit. Riboprinting. La méthode est basée sur l'analyse de restriction des gènes d'ARNr. Pour cela, l'ADN total est isolé de la cellule. Deux amorces homologues des régions flanquantes hautement conservées du gène de l'ARNr 16S (ARNr de petite sous-unité) sont prélevées et une PCR est réalisée. Les fragments sont traités avec plusieurs endonucléases de restriction, et les produits de restriction pour chacune des endonucléases sont séparés sur un gel d'agarose avec le profil de l'ADN de taille standard. Le polymorphisme de la longueur des fragments est dû au fait qu'une partie des sites de restriction tombe dans des domaines conservatifs du gène, et certains dans des domaines variables. Dans cette partie des fragments seront communs à toutes les espèces de l'échantillon. Par le nombre de fragments communs et différents, il est possible de calculer la distance génétique entre les espèces. L'utilisation de 12 enzymes de restriction avec des sites de reconnaissance de 4 nucléotides de long permet de couvrir 10-15% de la longueur du gène de l'ARNr 16S par analyse sans séquençage.

Cher Microbe

Valery Poroiko,
Ph.D., Université de Chicago, Département de chirurgie générale
Mécanique populaire ı4, 2008

Il y a tout juste cent ans, les microbes vivant dans les intestins étaient considérés comme des parasites et des parasites. Ces dernières années, le microbiote humain a été appelé une sorte d’organe de notre corps, nécessaire au fonctionnement normal de celui-ci.

Depuis l'époque de Pasteur, on sait que le tractus gastro-intestinal humain est essentiellement un bioréacteur de type à écoulement, dans lequel vivent de nombreux microorganismes. L'attitude des scientifiques à l'égard de la microflore intestinale a radicalement changé au cours de cette période. Il y a cent ans, le grand Ilya Mechnikov, fondateur de la théorie moderne de l'immunité, pour la création de laquelle il a reçu le prix Nobel (pour deux avec son adversaire implacable, le non moins grand Paul Ehrlich), a même proposé de supprimer le gros intestin comme moyen de prolonger la vie. Et à ceux pour qui cette mesure semblait trop radicale, j'ai recommandé de boire le plus de kéfir possible afin de supprimer les microbes nocifs, à son avis, avec des bactéries lactiques bénéfiques. Après un demi-siècle, le parcours a changé de 180 degrés. Il s'est avéré que la microflore intestinale normale, ainsi que la peau et les muqueuses, remplit de nombreuses fonctions utiles - par exemple, elle supprime l'activité vitale des micro-organismes pathogènes qui attaquent constamment le corps. Et au cours des dernières années, les microbiologistes les plus courageux sont allés encore plus loin, déclarant l'homme et ses microbes comme un simple superorganisme symbiotique.

Le développement des méthodes de biologie moléculaire a amené les scientifiques à un nouveau niveau de compréhension des processus de symbiose de l'homme et de sa microflore, ce qui semblait bien étudié et n'attendait aucune surprise particulière de la part d'une étude ultérieure. L’augmentation rapide de la vitesse et la baisse du coût des méthodes de séquençage de l’ADN (détermination de sa séquence nucléotidique) ainsi que l’augmentation parallèle de la puissance des ordinateurs personnels et du développement d’Internet ont permis d’analyser des informations sur de grandes régions du génome. Après avoir déchiffré les chromosomes de centaines d'espèces bactériennes individuelles, une nouvelle approche est apparue dans la génétique des microorganismes - basée sur la population: l'analyse des gènes de toutes les bactéries à la fois. Bien entendu, la population du «bioréacteur humain» s’est avérée être l’une des plus importantes pour l’étude des populations microbiennes.

Le premier travail, qui a conduit à un regard complètement nouveau sur le microbiote intestinal, a été publié en 1999 par un groupe de scientifiques de l'Institut national de recherche agronomique (France) et de l'Université de Reading (Grande-Bretagne). Les auteurs ont décidé d'appliquer la méthode de séquençage des gènes de l'ARN 16S à l'étude de la population microbienne de l'intestin (voir l'encadré).

16S PHK - Identification de la bactérie

La première étape dans la détermination des microorganismes est leur culture sur des milieux nutritifs. Mais un certain nombre de microbes ne veulent pas se développer dans aucun support.

Techniques modernes
Il a été possible d'étudier des bactéries non cultivées auparavant inaccessibles et de mettre de l'ordre dans la systématique extrêmement complexe de procaryotes déjà connus grâce au développement de méthodes modernes de biologie moléculaire - la PCR, qui permet d'obtenir des milliards de copies exactes à partir d'un seul segment d'ADN, en clonant des gènes sélectionnés dans des plasmides bactériens et en séquençant des techniques. nucléotides obtenus en quantité suffisante pour l'analyse. Le gène codant pour l'ARN ribosomal 16S (chacune des deux sous-unités du ribosome - ateliers de synthèse de protéines - est constitué de molécules de protéines entrelacées et de chaînes d'acides ribonucléiques) constitue un marqueur idéal pour l'identification de micro-organismes.

Marqueur parfait
Ce gène est dans le génome de toutes les bactéries et archées connues, mais il est absent chez les eucaryotes et les virus, et si vous avez trouvé sa séquence nucléotidique caractéristique, vous avez certainement affaire aux gènes des procaryotes. Ce gène a à la fois des régions conservatrices, les mêmes pour tous les procaryotes et des espèces spécifiques. Les sites conservateurs servent pour la première étape de la réaction en chaîne de la polymérase - attacher l’ADN à tester aux amorces (sites de germination de l’ADN auxquels la chaîne de nucléotides étudiée doit se joindre pour commencer à analyser le reste de la séquence), et spécifiques à une espèce - pour déterminer l’espèce. Le degré de similitude des parcelles spécifiques à une espèce reflète la parenté évolutive de différentes espèces. Pour le clonage et l'analyse ultérieure, vous pouvez utiliser l'ARN ribosomal lui-même, qui est présent dans n'importe quelle cellule en plus grande quantité que le gène correspondant. Les séquences nucléotidiques de l'ARN 16S de toutes les bactéries et archées connues sont largement disponibles. Les séquences identifiées sont comparées à celles des bases de données et identifient le type de bactérie ou le déclarent comme appartenant à l’espèce non cultivée.

Nouvelle taxonomie
Récemment, il y a eu une révision intensive de l'ancienne classification phénotypique des bactéries basée sur des critères peu formalisés - de l'apparition des colonies aux préférences alimentaires et à la possibilité d'être coloré avec divers colorants. La nouvelle systématique est basée sur des critères moléculaires (ARN 16S) et ne répète que partiellement le phénotypique.

Ce que nous avons à l'intérieur

Les séquences codantes de l'ARN 16S ont été extraites directement de «l'environnement» par 125 mg d'humain au moyen de la PCR (PCR). Les selles ont été insérées dans les plasmides d'Escherichia coli (non parce qu'il est intestinal, mais parce qu'Escherichia coli est l'un des produits préférés). les chevaux de travail de biologistes moléculaires) et ont de nouveau été isolés à partir d’une culture de bactéries propagées. Ainsi, la banque de gènes d'ARN 16S de tous les microorganismes de l'échantillon a été créée. Après cela, 284 clones ont été sélectionnés au hasard et séquencés. Il s'est avéré que seulement 24% des séquences d'ARN 16S obtenues appartenaient à des microorganismes connus antérieurement. Depuis plus de cent ans, les trois quarts de la microflore présente dans l'intestin de chaque personne ont échappé à l'attention de chercheurs armés des méthodes de la microbiologie classique! Les scientifiques n'ont tout simplement pas pu trouver les conditions pour la culture de ces bactéries, car les habitants les plus capricieux de l'intestin ont refusé de se développer sur des supports microbiologiques traditionnels.

Aujourd'hui, en utilisant des méthodes moléculaires, il a été établi que 10 des 70 grands taxons bactériens sont représentés dans le microbiote d'un adulte. Environ 90% de nos microbes appartiennent aux types Firmicutes (par exemple, les lactobactéries bien connues sont les principaux «coupables» du lait acidifiant) et les bactéroïdes sont des anaérobies obligatoires (organismes ne pouvant vivre que sans oxygène), qui sont souvent utilisés comme indicateurs de pollution eaux naturelles eaux usées. Les 10% restants de la population sont répartis entre les taxons de Protéobactéries (notamment E. coli), les Actinobactéries (l’antibiotique streptomycine a été isolé d’un type d’actinomycètes), les Fusobactéries (habitants de la cavité buccale et cause commune de la maladie parodontale), Verrucomicrobia (récemment). la source géothermique a la forme de ces microbes qui se nourrissent de méthane, abondant dans l’intestin en raison de l’activité vitale d’autres microorganismes), les cyanobactéries (on les appelle encore souvent «algues bleu-vert»), les spirochètes (heureusement). nd, non pâle), Synergistes et VadinBE97 (quel genre d'animaux, demandez aux créateurs de la nouvelle taxonomie des procaryotes).

Microbien en nous plus qu'humain

À cette fin, on utilise les technologies de séquençage d’ADN les plus automatisées, les plus informatisées et les plus performantes, qui permettent d’analyser de courtes séquences nucléotidiques, d’assembler un puzzle sur plusieurs lettres correspondantes aux extrémités de ces sections, de répéter à plusieurs reprises cette procédure pour chaque morceau du génome et d’obtenir le décodage de gènes individuels et de chromosomes. à une vitesse pouvant atteindre 14 millions de nucléotides par heure, soit des ordres de grandeur plus rapides qu’il ya quelques années. Ainsi, il a été découvert que le microbiote intestinal comptait environ 100 trillions de cellules bactériennes - environ dix fois plus que le nombre total de cellules dans le corps humain.

L'ensemble des gènes qui composent le métagénome bactérien est environ cent fois plus grand que l'ensemble des gènes du corps humain. Si nous parlons du volume de réactions biochimiques qui se produisent dans la population microbienne, il est encore plusieurs fois supérieur au volume de réactions biochimiques dans le corps humain.

Le «réacteur» bactérien met en œuvre dans l’organisme hôte des chaînes métaboliques qu’il ne peut pas supporter - par exemple, la synthèse de vitamines et de leurs précurseurs, la décomposition de certaines toxines, la décomposition de la cellulose en polysaccharides digestibles (chez les ruminants), etc.

De la petite enfance à la vieillesse

Bien que la composition en espèces des microorganismes intestinaux soit plutôt monotone, le rapport quantitatif des représentants de certains groupes systématiques dans le microbiote de différentes personnes peut varier considérablement. Mais quelle est la microflore intestinale normale et quels sont les moyens de sa formation?

Un groupe de biologistes américains dirigé par Patrick Brown de l’Université de Stanford a répondu à cette question en 2007. Ils ont retracé la formation de microbiote chez 14 nouveau-nés au cours de la première année de vie. Les auteurs ont pu établir plusieurs sources de colonisation du tractus gastro-intestinal. Le microbiote des bébés présentait des similitudes avec la microflore de la mère: vaginale, fécale ou microflore d'échantillons de lait maternel. En fonction des sources de colonisation, différentes espèces prévalaient dans la microflore intestinale des nourrissons au cours de la première année de vie. Ces différences sont restées significatives pendant toute la durée de l'étude, mais à l'âge d'un an, la formation du microbiote chez l'adulte est devenue perceptible. Des données intéressantes ont été obtenues sur l'exemple d'une paire de jumeaux. La microflore en eux était presque identique dans la composition et a changé de la même manière aussi. Cette découverte a révélé le rôle énorme de la composante humaine du couple microbiote-hôte dans la formation de la population de microflore intestinale. Pour la pureté de l'expérience, bien sûr, il serait nécessaire de séparer les bébés tout en restant à l'hôpital (au fait, une histoire merveilleuse pour un film indien! Au fil des années, les jumeaux ont appris à se connaître grâce aux analyses de microflore.). Mais les données provenant d'autres études ont confirmé l'hypothèse selon laquelle les caractéristiques individuelles, y compris héréditaires, de la biochimie humaine ont une grande influence sur la composition de son microbiote.

Mince et épais

Des études menées dans le laboratoire de Jeffrey Gordon (École de médecine de l'Université de Washington à St. Louis, dans le Missouri) ont permis d'associer la diversité des espèces de bactéries du tractus gastro-intestinal au régime alimentaire et aux caractéristiques métaboliques de l'individu. Les résultats de l'expérience ont été publiés dans le numéro de décembre 2006 du magazine Nature. L'expérience d'un an a suggéré d'établir une corrélation entre l'excès de poids chez l'homme et la composition de la population microbienne de ses intestins. Une douzaine de personnes grasses qui ont accepté de mettre leur ventre sur l'autel de la science ont été divisées en deux groupes. L'un a suivi un régime faible en gras, l'autre un régime faible en glucides. Tous les volontaires ont perdu du poids tout en modifiant le rapport entre les deux principaux groupes de micro-organismes intestinaux: le nombre de cellules Firmicutes a diminué et le nombre de Bacteroidetes, au contraire, a augmenté. Une telle modification est devenue perceptible plus tard avec un régime pauvre en graisses (après que les patients ont perdu 6% de leur poids et avec un régime faible en glucides) après avoir perdu les premiers kilogrammes (2% de leur poids corporel initial). Dans ce cas, l’évolution de la composition de la microflore était d’autant plus prononcée que le poids des participants à l’expérience diminuait.

Combattre l'obésité

Les résultats d'une étude ultérieure des scientifiques sur les modifications de l'organisme symbiotique souris-microbien (voir l'encadré "Testé sur des souris") ont confirmé avec brio l'hypothèse selon laquelle le microbiote d'individus obèses contribue à un traitement plus en profondeur des aliments. La comparaison d'échantillons d'ADN de selles de souris obèses et normales a montré que les microbiomes d'obésité sont saturés de gènes d'enzymes qui permettent une dégradation plus efficace des polysaccharides. Les intestins de souris grasses contenaient de grandes quantités de produits finis de la fermentation - composés d'acides acétique et butyrique -, ce qui indique un traitement plus en profondeur des composants alimentaires. Analyse calorimétrique (du mot «calories»!) L'analyse d'échantillons de selles de souris l'a confirmé: les selles de souris ob / ob contenaient moins de calories que les souris de type sauvage qui n'absorbaient pas pleinement l'énergie des aliments.

Outre les informations importantes sur la composante «microbienne» de l'obésité, les auteurs ont pu montrer la similitude fondamentale de la microflore chez les personnes obèses et les souris, ce qui ouvre de nouvelles perspectives pour l'étude du problème du surpoids et, éventuellement, pour la «transplantation» de la microflore saine ou de sa formation chez le patient. obèse.

Testé sur des souris

Et avec épuisement

Le fait que le microbiote puisse contrôler le métabolisme de l'hôte ne fait plus de doute. Le laboratoire de recherche Gordon, consacré au problème du surpoids, a permis de jeter un pont vers le traitement des maladies métaboliques. Parmi eux figurent des types d'épuisement général touchant les enfants de un à quatre ans dans les pays pauvres à climat tropical, tels que marasme (ce mot n'a qu'un rapport linguistique avec le marasme: grec marasmoz signifie littéralement épuisement, extinction) et kwashiorkor (dans la langue de l'une des tribus Ghana kwashiorkor - "garçon rouge"). L’émergence de maladies est associée à un manque de protéines et de vitamines pendant la transition de l’allaitement à la nourriture pour adultes. Mais les maladies affectent de manière sélective les enfants dont les frères et sœurs n’ont rencontré aucun problème lors du passage au régime traditionnel de la région. Des études ont montré que la microflore intestinale des enfants malades est très différente de la microflore de leurs parents et de celle des frères et sœurs en bonne santé. Tout d'abord, il a été noté l'absence presque complète de bactéroïdes dans la population intestinale et la prédominance d'espèces rares appartenant aux types de protéobactéries et de fusobactéries. Après que les enfants malades (soigneusement, afin de ne pas faire une overdose!) Aient été nourris avec des aliments riches en protéines, leur microbiote semblait être un microbiote normal, comme chez des proches, avec une prévalence de Bactrotetes et de Firmicutes.

Des études récentes ont non seulement fondamentalement changé la compréhension actuelle de la microflore intestinale humaine, mais ont également contribué à l'émergence d'un concept qui considère le microbiote intestinal comme un «organe» humain multicellulaire supplémentaire. Organe composé de différentes lignées cellulaires capables de communiquer entre eux et avec l'organisme hôte. Le corps qui redistribue les flux d'énergie, effectue des réactions physiologiques importantes, change sous l'influence de l'environnement et s'auto-régénère lorsque des changements sont causés par des conditions extérieures. Poursuivre l’étude de «l’organe bactérien» peut et devrait permettre de mieux comprendre les lois régissant son fonctionnement, de révéler ses liens subtils avec l’organisme hôte et, partant, d’apparaître de nouvelles méthodes de lutte contre les maladies humaines par le traitement ciblé des dysfonctionnements des deux composants du métaorganisme.

Analyse 16s ARN

Les acides ribonucléiques ribosomiques (ARNr) sont plusieurs molécules d'ARN qui forment la base du ribosome. La fonction principale de l'ARNr consiste à effectuer le processus de traduction - à lire les informations de l'ARNm à l'aide de molécules adaptatrices d'ARNt et à catalyser la formation de liaisons peptidiques entre les acides aminés liés à l'ARNt.

Le contenu

Sous-particules ribosomales et nomenclature des ARNr

Sur les images au microscope électronique de ribosomes intacts, il est visible qu'ils se composent de deux sous-particules de tailles différentes.

Le rapport de masse des sous-particules est

2: 1; les masses, à leur tour, sont exprimées en constantes de sédimentation directement mesurées (vitesse de sédimentation en unités de Svedberg, S) lors de l’ultracentrifugation, c’est ce paramètre qui a constitué la base de la nomenclature des ARNr et ribosomes et sous-particules ribosomales: les désignations de types sont utilisées

Par exemple, l'ARN ribosomal de procaryotes avec un coefficient de sédimentation de 16 unités de Svedberg est appelé ARNr 16S.

Les coefficients de sédimentation dépendant non seulement du poids moléculaire, mais également de la forme des particules, les coefficients de sédimentation lors de la dissociation ne sont pas additifs: par exemple, des ribosomes bactériens de masse moléculaire

3.10 6 Dalton a un coefficient de sédimentation de 70S, désigné par 70S et se dissocie en sous-unités 50S et 30S:

Les sous-unités ribosomales contiennent chacune une molécule d’ARNr de longue durée, dont la masse est

1/2 - 2/3 de la masse du sous-particule ribosomal, ainsi, dans le cas des ribosomes 70S bactériens, la sous-unité 50S contient l'ARNr 23S (longueur

3 000 nucléotides) et la sous-unité 30S contient l’ARNr 16S (longueur

1500 nucléotides); Outre le «long» ARNr, la grande sous-unité ribosomique contient également un ou deux «courts» ARNr (ARNr 5S des sous-unités bactériennes ribosomales 50S ou 5S et 5.8S des plus grandes sous-unités ribosomales des eucaryotes).

La synthèse

L'ARN ribosomal représente une proportion importante (jusqu'à 80%) de l'ARN cellulaire total, une telle quantité d'ARNr nécessite une transcription intense de ses gènes codants. Cette intensité est fournie par un grand nombre de copies des gènes codant pour l'ARNr: chez les eucaryotes, il en existe plusieurs centaines (

200 dans la levure) à des dizaines de milliers (pour différentes lignées de coton, 50 à 120 000 exemplaires ont été rapportés) de gènes organisés en réseaux de répétitions en tandem.

Chez l’homme, les gènes codant pour l’ARNr sont également organisés en groupes de répétitions en tandem situées dans les régions centrales du bras court des chromosomes 13, 14, 15, 21 et 22.

Ils sont synthétisés par l'ARN polymérase I sous la forme d'une longue molécule d'ARN pré-ribosomal, qui est coupée en ARN séparés qui forment la base des ribosomes. Chez les bactéries et les archées, le transcrit initial comprend généralement l'ARNr 16S, 23S et 5S, entre lequel les séquences de pré-ARNr sont supprimées. Habituellement, entre les gènes d'ARNr 16S et 23S se trouve un ou plusieurs gènes d'ARNt; alors, dans E. coli, la transcription initiale d'un tel groupe de gènes a la séquence suivante:

(ARNr 16S) - (1-2 ARNt) - (ARNr 23S) - (ARNr 5S) - (ARNt 0-2)

Un tel transcrit est clivé en fragments de pré-ARN et ARNt par l'enzyme ribonucléase III.

Chez les eucaryotes, les ARNr 18S, 5.8S et 25/28 sont co-transcrits avec l'ARN polymérase I, tandis que le gène de l'ARNr 5S est transcrit avec l'ARN polymérase III.

Chez les eucaryotes, les sites de concentration des gènes codant pour l'ARNr sont généralement bien visibles dans le noyau de la cellule, en raison de l'accumulation de sous-unités de ribosomes autour d'elles, qui sont immédiatement assemblées. Ces grappes sont bien colorées avec des colorants cytologiques et sont appelées nucléole. En conséquence, la présence de nucléoles n'est pas caractéristique de toutes les phases du cycle cellulaire: lors de la division cellulaire dans la prophase, le nucléole se dissocie car la synthèse de l'ARNr est suspendue et se reforme à la fin de la télophase lorsque la synthèse de l'ARNr reprend.

Analyse comparative des ARNr pro et eucaryotes

Les ARN ribosomaux (comme les ribosomes) des procaryotes et des eucaryotes diffèrent l'un de l'autre, bien qu'ils présentent une similitude significative entre les régions des séquences. Le ribosome procaryote 70S comprend une grande sous-unité 50S (construite sur la base de deux molécules d'ARNr - 5S et 23S) et une petite sous-unité 30S (construite sur la base d'ARNr 16S). Le ribosome eucaryote 80S comprend une grande sous-unité 60S (construite sur la base de trois molécules d'ARNr - 5S, 5.8S et 28S) et une petite sous-unité 40S (construite sur la base d'ARNr 18S).

Utilisation des informations de séquence

Les informations sur l'ARNr d'un organisme particulier sont utilisées en médecine et en biologie de l'évolution.

  • Le gène de l'ARNr est l'un des gènes les plus conservateurs (les moins variables). Par conséquent, la position systématique de l'organisme et le temps de divergence avec les espèces voisines peuvent être déterminés sur la base d'une analyse des similitudes et des différences dans les séquences d'ARNr.
  • L'ARNr est une cible pour un grand nombre d'antibiotiques, dont certains sont utilisés en pratique clinique, à la fois pour supprimer la croissance des bactéries (antibiotiques qui se lient au ribosome procaryote) et pour traiter les maladies humaines (antibiotiques qui se lient au ribosome eucaryote). Le premier groupe comprend le chloramphénicol, l'érythromycine, la kasugamycine, la microcoxine, la spectinomycine, la streptomycine, le thiostrepton. À la deuxième hygromycine B, la paromomycine.

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